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干细胞作为一种能够自我更新和分化的细胞类型，自被发现起，干细胞就一直是研究热点。间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSC）是成体干细胞家族的重要成员，来源于发育早期的中胚层和外胚层。MSC最初在骨髓中发现，后期研究发现MSC广泛存在于人体的许多种组织中。MSC具有多向分化潜能、造血支持和促进干细胞植入、免疫调控和自我复制等特点。如MSC在体内或体外特定的诱导条件下，具有向成骨细胞、成软骨细胞、成脂肪细胞、骨髓基质和心肌细胞分化能力，不仅如此，它还可以跨胚层分化为神经细胞、肝脏细胞、胰岛细胞等。经连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的工具细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复。
MSC已成临床研究与应用的热点。截止2021年4月，在ClinicalTrials.gov网站检索到的间充质干细胞临床试验超过1200个。近年来，这个数字持续增长，表明间充质干细胞的重要性日益增强。据不完全统计，全球曾经获准上市的间充质干细胞产品有18款，符合药品定义的有10款。目前，我国的干细胞药物研发愈发规范，吸引大量资本和人才进入。
全球干细胞疗法大多处在技术到产品转化的阶段。在体外进行细胞规模化的高效扩增MSC，是应用和转化的关键。本研究基于微载体，利用bet356亚洲体育SKC300生物反应器无血清培养间充质干细胞，结果证实具有良好的应用前景。
01
实 验 材 料
细胞：间充质干细胞
培养方式：微载体Cytodex 1贴壁培养
培养基：干细胞培养基
反应器：bet356亚洲体育SKC300生物反应器-7.5L
图1 bet356亚洲体育SKC300生物反应器及搅拌桨
实 验 步 骤
1. 微载体预处理
1.1微载体处理：Cytodex1使用DPBS溶胀3h。
1.2使用DPBS洗涤2次Cytodex1，DPBS浸泡后灭菌（121℃，30min）。
1.3 Cytodex1瓶内弃上清，瓶内无血清培养基洗涤2次。
2. bet356亚洲体育SKC300生物反应器的操作
2.1 使用前极化pH,DO电极6小时，校准pH电极。
2.2 SKC300罐体121℃灭菌1小时后，与控制系统连接好。将培养液从储液袋加入到罐体内。
2.3 无菌实验。转速：40-60rpm，pH：7.4，DO：50%，流量0.2L/min，三气体或四气体模式。
3. MSC细胞培养及接种过程
3.1 按6000cells/cm2接种新鲜MSC细胞至微载体培养液中，将微载体和细胞的混合悬液一起加入到罐体中。
3.2 培养参数转速：40-60rpm，pH：7.4，DO：50%，流量0.2L/min，三气体模式。
3.3 每天从罐内无菌取样口用无菌注射器抽取5ml-10ml培养液，进行细胞计数，生化，镜检，支原体、内毒素等安全性质量检测。
3.4 培养4-5天收获。
4. MSC细胞的收获
4.1培养4-5天后将罐内微载体悬浮液从罐内转移至消化袋（消化袋如图2所示）。
4.2 直接抽出上清，DPBS洗涤两遍，加入Tryple消化酶，温和摇匀消化6min-15min。从取样口取样观察消化情况，当细胞完全与微载体分开后，从袋内抽出细胞悬液。加入DPBS洗涤2遍。
4.3 细胞悬液400×g离心，5min。收集细胞，计数。
图2 bet356亚洲体育自主研发生产的细胞培养消化袋
03
实 验 结 果
① 细胞生长情况
按6000cells/cm2接种新鲜MSC细胞至微载体，培养4天后细胞在微载体生长情况见图3。
图3微载体培养MSC
② 细胞消化情况
转移至消化袋后利用Tryple消化酶，温和摇匀消化6min-15min，细胞消化状态如图4所示。
图4 细胞消化状态（消化12min）
③ 细胞密度情况
接种后每天从罐内无菌取样口用无菌注射器抽取5ml-10ml培养液，进行细胞计数，结果如图5所示。
图5A 细胞密度（微载体密度12g/L）
图5B 细胞密度（微载体密度18g/L）
根据上面的实验结果，在bet356亚洲体育SKC300生物反应器培养MSC细胞不仅可以高密度微载体培养，而且具有良好的一致性。
参考文献
[1] Y Jiang, Jahagirdar, N Balkrishna,et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow.[J]. Nature, 2002.
[2] 王蓓, 汪维伟. 间充质干细胞的研究进展[J]. 国外医学:外科学分册, 2005.
[3] Vallone V, Romaniuk M A, Choi H , et al. Mesenchymal stem cells and their use in therapy: What has been achieved?[J]. Differentiation, 2013.
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